簡(jiǎn)要描述:RNA干擾 (RNA interference, RNAi)技術(shù),是將與內源mRNA 編碼區同源的小片段(19 -23bp)外源雙鏈 RNA(siRNA)導入細胞中,引發(fā)細胞中相應mRNA 高效特異性降解,從而導致特定基因表達沉默(knock down)的一種實(shí)驗技術(shù)。
siRNA干擾檢測服務(wù)
原理:RNA干擾 (RNA interference, RNAi)技術(shù),是將與內源mRNA 編碼區同源的小片段(19 -23bp)外源雙鏈 RNA(siRNA)導入細胞中,引發(fā)細胞中相應mRNA 高效特異性降解,從而導致特定基因表達沉默(knock down)的一種實(shí)驗技術(shù),其中通過(guò)構建表達載體表達siRNA是多種siRNA制備方法中*有可能進(jìn)行長(cháng)期基因沉默研究的方法,siRNA 載體可以在細胞內直接轉錄出shrna ,其干擾效果等同于siRNA ,而且能夠解決 siRNA干擾時(shí)間短的缺點(diǎn)。您只需提供需干擾基因的詳細信息,包括基因的 mRNA 序列,Genbank Accession No. 和所屬物種,本公司負責設計3條針對目的mRNA的siRNA 靶序列,在短時(shí)間內構建三個(gè)可用于目的mRNA干擾實(shí)驗的siRNA 載體并為您進(jìn)行后續的干擾實(shí)驗研究。
實(shí)驗流程
◇ 選擇siRNA表達載體 通過(guò)人工合成基因的方法將該序列克隆至Clontech公司的RNAi-Ready pSIREN系列表達載體中,該系列表達載體帶有Pol III(U6)啟動(dòng)子,具有轉染效率高、操作簡(jiǎn)單、rna沉默效果易于檢測等特點(diǎn),客戶(hù)可根據需要進(jìn)行選擇。
◇ 設計siRNA靶序列
◇ 根據客戶(hù)提交的目的mRNA序列,設計3條RNA干擾靶序列,靶序列一般為19-21nt 長(cháng)。
◇ 對于每條選定的siRNA 靶序列,設計 siRNA 正義鏈和反義鏈,以 loop(9nt or 10nt) 相連,形成穩定的發(fā)卡RNA,稱(chēng)為 shRNA(short hairpin RNA)。
◇ 合成模板 合成每條編碼 shRNA的DNA 模板,并連接到 siRNA 載體相應的多克隆位點(diǎn)之間。連接產(chǎn)物轉化DH5α大腸桿菌。
◇ 抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒 公司試劑盒抽提陽(yáng)性克隆載體并定量。
◇ 轉染細胞 質(zhì)粒直接轉染或通過(guò)病毒包裝后轉染細胞,并對轉染細胞進(jìn)行陽(yáng)性鑒定和轉代細胞株的培養。
◇ 干擾效果檢測
◇ 基因水平上檢測 提取RNA、反轉錄、Realtime PCR檢測干擾效果(客戶(hù)自備細胞系)。
◇ 蛋白水平上檢測 Western Blot檢測蛋白水平干擾效果(客戶(hù)自備一抗)。
服務(wù)周期及價(jià)格
服務(wù)內容 | 價(jià)格(¥) | 周期 |
siRNA 載體構建1~3個(gè) | 1800元/個(gè) | 14個(gè)工作日 |
siRNA 載體構建3~10個(gè) | 1500元/個(gè) | 20個(gè)工作日 |
siRNA 載體構建10個(gè)以上 | 詢(xún)價(jià) | 協(xié)商 |
細胞培養、轉染 | 5000元/基因 | 1~2周 |
基因水平上檢測干擾效果 | 詢(xún)價(jià)(視檢測數量商定) | 5~6周 |
蛋白水平上檢測干擾效果 | 詢(xún)價(jià)(視檢測數量商定) | 5~6周 |
服務(wù)說(shuō)明
◇ siRNA服務(wù)需客戶(hù)與我們共同討論實(shí)驗方案,并提供靶基因名稱(chēng)、序列或GeneBank ID和希望插入載體的名稱(chēng)等,免費為您設計siRNA序列。
◇ 由于構建的siRNA表達載體中插入的片段可以形成hairpin結構,因此可能會(huì )影響測序。如果我們對質(zhì)粒測序結果不理想時(shí),將對由質(zhì)粒擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。
◇ 開(kāi)始實(shí)驗時(shí)公司和客戶(hù)簽訂詳細的實(shí)驗技術(shù)服務(wù)合同、保密合同,客戶(hù)需預付合同金額的50%作為預付款。
提供結果
實(shí)驗報告包括:siRNA序列、構建載體的測序報告、熒光定量PCR檢測報告、Western Blot圖片及全部實(shí)驗數據和詳細的實(shí)驗步驟。